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自體血小板濃縮物(APC)PRP、PRF、CGF的制備方法

  • 分類:熊貓課堂
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  • 發(fā)布時間:2024-12-09 11:40
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【概要描述】自體血小板濃縮物(APC)PRP、PRF、CGF的制備方法。富血小板血漿(PRP)、富血小板纖維蛋白(PRF)和濃縮生長因子(CGF)。這些APC具有不同的結(jié)構(gòu)特征,具體取決于不同的制備方法,并包含血小板、白細(xì)胞和多種生長因子。

自體血小板濃縮物(APC)PRP、PRF、CGF的制備方法

【概要描述】自體血小板濃縮物(APC)PRP、PRF、CGF的制備方法。富血小板血漿(PRP)、富血小板纖維蛋白(PRF)和濃縮生長因子(CGF)。這些APC具有不同的結(jié)構(gòu)特征,具體取決于不同的制備方法,并包含血小板、白細(xì)胞和多種生長因子。

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       使用患者自身外周血的自體生長因子在生物學(xué)上實現(xiàn)了組織再生的進一步改善。血液制品用于非輸血應(yīng)用受嚴(yán)格的法規(guī)約束。在歐洲共同體內(nèi)部,歐洲議會和理事會 2003年1月27日的第 2002/98/EC 號指令中規(guī)定的現(xiàn)行法規(guī)的主要目標(biāo)是確保高水平的人類健康保護。在歐洲層面,有一個基本原則,即血液成分只有在獲得負(fù)責(zé)輸血活動的國家當(dāng)局授權(quán)后才能使用。

      在一些歐洲國家,血液成分被歸類為血液衍生物,而在其他國家,它們被視為醫(yī)藥產(chǎn)品。
      濃縮血小板無疑是通過簡單的物理方法(如離心和分離)制備的,只要這些程序不用于實驗?zāi)康幕蝮w細(xì)胞治療 。自體血小板濃縮物 (APC) 可以定義為從患者全血離心中提取的制劑。結(jié)果是含有高濃度血小板、白細(xì)胞和生長因子的生物材料。事實上,血小板含有高水平的生長因子,如 PDGF、TGF-β 1 和 -β2、VEGF、FGF 和胰島素樣生長因子-1 (IGF-1),所有這些都參與細(xì)胞增殖、基質(zhì)重塑和血管生成 。
      近年來,APC在促進傷口愈合和組織再生方面的功效一直是科學(xué)界相當(dāng)感興趣的主題。由于血小板濃縮物能夠促進參與肌腱、韌帶、骨骼和軟骨再生的細(xì)胞的募集、增殖和成熟,因此可能對血液供應(yīng)有限、細(xì)胞更新緩慢和細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)有限的組織有益。
      在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有各種應(yīng)用,包括刺激牙科、整形外科和種植學(xué)中的組織再生,難治性潰瘍或燒傷的愈合,肌肉骨骼損傷、肌腱和韌帶的修復(fù),以及骨關(guān)節(jié)炎的治療。
      使用血小板衍生物的主要優(yōu)點是它們的自體性質(zhì)以及收集和制備的簡單性。根據(jù)其特性和所需的制備方法如下:
 
01  富血小板血漿(PRP)
 
          富血小板血漿 (PRP),其發(fā)現(xiàn)可以追溯到 1970 年。PRP 來源于患者的全血,通過兩階段離心過程獲得:分離和濃縮。在分離階段,將 4 等分試樣 8 mL 全血收集在無菌管中,該管含有以 5600 rpm 及抗凝劑。這導(dǎo)致分離為三個層:

        1.第一層包含貧血小板血漿 (PPP),占總體積的 40%;

        2.中間層稱為血沉棕黃層 (BC),包含血小板和白細(xì)胞,僅占總體積的 5%;

       3.底層由紅細(xì)胞 (RBC) 組成,占總體積的 55%。

      制備:將血液收集在含有抗凝劑溶液的無菌管中,并首先以 5600 rpm 離心。形成三層:PPP、BC 和 RBC。將 PPP、BC 和一小部分 RBC 轉(zhuǎn)移到另一根沒有抗凝劑的管子中。然后以 2400 rpm 離心,形成三個不同的層:底部的殘留 RBC、頂部的 PPP 和稱為 PRP 的中間層。為了獲得“活化的”PRP,加入牛凝血酶和氯化鈣的混合物以活化血小板,由于血小板摻入纖維蛋白網(wǎng),它以凝膠形式出現(xiàn)。
      據(jù)估計,PRP 中血小板和生長因子的濃度比外周血高 3-5 倍 。根據(jù)血小板和白細(xì)胞含量,PRP 可進一步分為兩類:貧白細(xì)胞或純富血小板血漿 (P-PRP) 和富白細(xì)胞和富血小板血漿 (L-PRP)。
      PRP 已被證明含有許多參與組織修復(fù)的生長因子,但它有一個明顯的缺點:它的制備需要使用抗凝劑和牛凝血酶來誘導(dǎo)纖維蛋白聚合,這會干擾生理愈合過程。

 

02   富血小板纖維蛋白(PRF)

      由 Choukroun 于 2000 年推出。在這種情況下,在不使用抗凝劑的情況下采集 10 mL 的靜脈血,并以 3000 rpm 離心 10 分鐘。在這個過程結(jié)束時,獲得三層:
由紅細(xì)胞組成的下層,含有纖維蛋白凝塊的中間層,稱為PRF,以及血漿的上層,PPP 。

      制備:在不使用抗凝劑的情況下收集 10 mL 的靜脈血,然后以 3000 rpm 離心 10 分鐘。在這個過程結(jié)束時,獲得三個不同的層:由 RBC 組成的底層,包含纖維蛋白凝塊的中間層,稱為 PRF,以及由血漿組成的頂層,PPP。

      在沒有抗凝劑的情況下,在與管壁接觸的幾分鐘內(nèi),血小板被激活,凝血因子被釋放。最初,纖維蛋白原集中在管的上部,然后外源性凝血酶將其轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,纖維蛋白位于紅細(xì)胞層和脫細(xì)胞血漿層之間的管中心。
      PRF的細(xì)胞成分包括白細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。這些細(xì)胞在此過程中起著重要作用。血小板有助于愈合的初始階段,而白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與抗炎階段。
      PRF可進一步細(xì)分為白細(xì)胞貧或純富血小板纖維蛋白 (P-PRF)、富含白細(xì)胞和血小板的纖維蛋白 (L-PRF) 和可注射的富血小板纖維蛋白 (I-PRF) 。

      L-PRF 的白細(xì)胞含量低,但血小板攝取能力高,可保持血小板完整性。與 PRGF 一樣,P-PRF 中的纖維蛋白聚合是由氯化鈣誘導(dǎo)的,但與所有類別的 PRP 相比,所得的纖維蛋白基質(zhì)更致密、更穩(wěn)定。另一方面,L-PRF 是第一種不使用抗凝劑或膠凝劑的血小板濃縮物。這確保了血小板和白細(xì)胞的完整性,它們?nèi)匀淮罅勘焕г诿芗睦w維蛋白網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)中,這是 L-PRF 的特征 。最后,通過降低 PRF 的離心速度(700 rpm,3 min)開發(fā)了 I-PRF,從而產(chǎn)生可以注射到軟組織、粘膜或皮膚中的液態(tài) PRF。事實上,通過降低離心的速度和持續(xù)時間,可以延遲纖維蛋白凝固的過程。因此,由纖維蛋白原和凝血酶組成的產(chǎn)物在離心后以液態(tài)保持約 20 分鐘,然后最終形成纖維蛋白。這一特性使其成為面部年輕化應(yīng)用的合適物質(zhì)。

      隨后PRF 制備方案以獲得富血小板纖維蛋白 (A-PRF)。在這里,樣品以較低的速度離心更長的時間(1500 rpm 14 分鐘)。由于這種修飾,與 P-PRF 和 L-PRF 相比,A-PRF 中形成的纖維蛋白凝塊更柔軟,并且其中存在的血小板數(shù)量增加 。

 

03   濃縮生長因子(CGF)

       Sacco 于 2006 年開發(fā)的 PRF 的改良形式。通過使用特異性離心機,以交替速度離心血液樣品 (8 mL) 13 分鐘(2700 rpm 下 2 分鐘,2400 rpm 下 4 分鐘,2700 rpm 下 4 分鐘,3000 rpm 下 3 分鐘)獲得 CGF,Medifuge MF200(Silfradent srl,意大利)。在該程序結(jié)束時,可以在樣品中觀察到三個不同的層 :

      血漿的上層 PPP、包含纖維蛋白和生長因子 CGF 的中間層以及 RBC 的下層。中間層稱為 CGF,可進一步細(xì)分為上部白色部分、下部紅色部分和中間 BC 。

      CGF制備。通過將血液樣品以交替速度離心總共13分鐘來獲得 CGF:2700 rpm 時 2 min,2400 rpm 下 4 min,2700 rpm 下 4 分鐘,3000 rpm 下 3 min。此過程后,樣品分離成三個不同的層:上層由血漿、PPP 組成,中間層由 CGF 組成,底層由 RBC 組成。CGF 可以進一步細(xì)分為三個部分:上部白色部分、下部紅色部分和中間 BC。

 

      PRF 和 PRP 相比,交替速離心過程可形成更致密的纖維蛋白基質(zhì),其中包含更多的生長因子和細(xì)胞。纖維蛋白支架是一個包含血小板、白細(xì)胞和 CD34+ 細(xì)胞的致密網(wǎng)絡(luò)。CGF 中含量更高的生長因子包括 PDGF、TGF-β 1、FGF-b、VEGF、IGF-1、EGF 和 BMP。它們被困在纖維蛋白基質(zhì)中并逐漸釋放,確保再生特性得到控制和持續(xù),并降低與過量生長因子相關(guān)的炎癥反應(yīng)的風(fēng)險。

 
      文獻(xiàn)報道,PRP激活使用一小時內(nèi)釋放其所有生長因子含量,僅參與再生過程的初始階段。PRF會連續(xù)釋放其生長因子長達(dá)7-10天,而A-PRF的釋放似乎持續(xù)長達(dá)14天 。為了支持這一點,Schär 等 還分析了 PRP 和 PRF 在 28 天培養(yǎng)期內(nèi)生長因子的釋放。他們觀察到 PRP 在培養(yǎng)開始時釋放了大部分生長因子,而 PRF 隨著時間的推移釋放了更一致的結(jié)果。此外,Kobayashi 等 比較了 PRP、PRF 和 A-PRF 釋放生長因子的情況,但時間更短(10 天)。PRP 最初釋放的生長因子量最高,但在整個時間內(nèi),PRF 和 A-PRF 釋放的生長因子量較高。
      生長因子被認(rèn)為是組織再生的基本元素,在調(diào)節(jié)傷口愈合和組織修復(fù)過程中起著重要作用。因此,它們的數(shù)量和釋放動力學(xué)對于確定 CGF 的有效性可能很重要。在 CGF 釋放的多種生長因子中,VEGF 是組織再生的關(guān)鍵分子,因為它參與血管生成和血管生成過程。
 
      近年來由于再生醫(yī)療的發(fā)展,市場上國內(nèi)產(chǎn)品日益增多,尤其是PRP制備套裝在中國CFDA可以查到已經(jīng)有30多家品牌,通過血液自身沉降機理在進口及國產(chǎn)前輩的基礎(chǔ)上很多廠家離心管做了升級,優(yōu)化了一些不足之處,盡管有這么多的品牌其制備的標(biāo)準(zhǔn)制定迫在眉睫.......讓我們一起探索APC的奧秘吧。
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